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page名改新. 06Mar 2017

MPL mutation in patients with MPN

MPL:myeloproliferative leukemia virus oncogene [ Homo sapiens ]
Gene ID: 4352, Official Symbol: MPL provided by HGNC
Also known as MPLV; TPOR; C-MPL; CD110; THCYT2
OMIM http://omim.org/entry/159530

1990年, 異なる系統の骨髄造血細胞を不死化する能力のあるマウス骨髄増殖白血病ウイルスから, がん遺伝子, v-mpl が認められた。1992年にはヒトホモローグのc-mpl がクローン化される。
シークエンスデータより, c-mplは造血受容体スーパーファミリーの一員と相同性のあるタンパクをエンコードしており, c-mplをアンチセンスオリゴで妨害すると巨核球コロニー形成が障害される。

c-mplのリガンドであるトロンボポイエチン(TPO)が1994年にクローン化された。TPOは巨核球と血小板形成の主要な制御因子である。

c-mpl遺伝子がエンコードするタンパク質, トロンボポイエチン受容体[TPOR](c-MPL(Myeloproliferative leukemia protein)やCD110などとも呼ばれる)

  • 血小板を産生する巨核球の分化・増殖作用を有するトロンボポエチンの受容体である。-635アミノ酸で, 膜貫通ドメイン、2つの細胞外サイトカイン受容体ドメイン, 2つの細胞内サイトカイン受容体ボックスモチーフから形成される。
  • TPO-R 欠損マウスは重症血小板減少をきたし, CD110とトロンボポイエチンの巨核球, 血小板形成における重要性が強調される。
  • またTPORは、造血幹細胞(赤血球、白血球、巨核球などに分化する骨髄中の幹細胞)の維持への関与も示唆されている。
  • この受容体はトロンボポエチンが結合することでダイマーを形成し活性化し、JAK/STATなどのシグナル経路が刺激される, さらに STAT ファミリー, MAPK ファミリー, アダプタータンパクShc, および受容体それ自身のチロシンがリン酸化され, 細胞外部からの信号を細胞の核へ伝達する。
  • なお、c-mpl遺伝子の選択的スプライシングにより、c-MPL-P(wild type)とc-MPL-K(truncated)の二つのアイソフォームが存在する。

MPNに認められるMPL gene mutation

 
c-mpl.jpg

近年, MNPの症例にthrombopoietin receptor(MPL)geneの新たな2つの体細胞変異が報告された。

MPL W515LおよびW515K(前者の頻度がより高い)は膜貫通ドメイン(492-513aa)ごく近傍にあたり, 受容体のダイマー形成に重要な部分と考えられる。トリプトファンがロイシンあるいはリジンに変換された単アミノ酸変化はJAK V617Fと同様にJAK-STAT経路の構造的活性化をまねくgain-of-function変異となっている*1*2

MPL mutation検出のPCR primer *3

A) 5' CCTGCTGCTGCTGAGGTTGC 3' : Allele-specific forward primer 3' endより3番目のG(Tryptophan:wild-type)-->T(W515L):トリプトファンがロイシンに変換。

B) 5' AGTAGGGGCTGGCTGGAT 3': outer, forward primer (intron9に設定。)

C) 5' CTAGTCGCCGAGGTGAGC 3': reverse primer (intron 10 ): 5' outer(wild-type)のPCR, AS-PCR両方に使うようです。

94℃ 30sec, 65℃ 30sec, 72℃ 60sec x 35 cycles

wild-type 409bp productがouter pairにより形成、mutantは297bpのバンドをあらわす。

文献*4によればJAK2 V617F-negative ET''patientsの8.5%, JAK2 V617F- negative PMFの10%にMPL W515の変異が検出されているPVでは0%であった

関連ページ

MPL proto-oncogene, thrombopoietin receptor (MPL)

Essential thromobocythemia 本態性血小板血症

JAK2, MPLの異常がみられないMPNにおけるエピジェネティック制御因子異常

TET2 and ASXL1 pathogenic mutations are found in 8% of MPN lacking JAK2 and MPL mutations, whereas IDH1, IDH2, and c-CBL mutations are not detected in this subset of patients.*5

CARL exon9 の欠失挿入変異:JAK2, MPL変異のないMPNに認められる遺伝子変異

CALRcalreticulin
also known as: RO; CRT; SSA; cC1qR; HEL-S-99n
Location: 19q13.3-p13.2, 9 exons
OMIM myelofibrosis http://omim.org/entry/254450 thrombocythemia 1 http://omim.org/entry/187950
carleticulin(CALR) http://omim.org/entry/109091

 
CALRmut-ET-PMF.jpg

essential thrombocytemia(ET), myelofibrosis (MF)ではJAK2変異, MPL変異がおのおの50-60%, 5-10%に認められる。 両方の変異が認められない30-45%の症例には特異な遺伝子異常は検出されていなかった。
JAK, MPL変異のないMF 6例にwhole exome sequencingを行い全例にcalreticulin(CALR)をコードするCALR遺伝子のexon9に挿入, 欠失の体細胞変異を認めた。*6

  • 1107例のMPNを調査。polycytemia vela (PV)にはCALRの変異なし. JAK2/MPL変異のないETでは67%, MFでは88%にCALR変異が検出された。
     
  • 36種類の挿入, 欠失パターンすべてが, 同じ変異reding frameへフレームシフトを起し,新しいC末端ペプチドをもつmutant calreticulinを産生する(右図)
  • このC-terminusタンパク質をターゲットとするCALR変異タンパク抗体が市販されている.
     
  • CALRの最も多い欠失変異はin vitroでcytokineに依存しないSTAT5活性化による成長をうながす。その機序は不明である。--->MPLとの関係について下記参照
     
  • CALR変異症例はJAK2変異症例に比べ血栓症はすくなく長期に生存可能である。
     
  • すべてのCALR変異はCALR遺伝子exon9に集中し一様にC末端酸性ドメイン, 多数のカルシウム結合サイトおよびKDELシークエンスのほとんどを消失することになる。この変異はMPNの腫瘍形成初期におこるとされる*7
     
  • マクロファージが介在する免疫回避, 小胞体ストレス反応(unfolded protein reaction:UPR)の活性化, カルシウムシグナルなどにかかわるCALRの役割と腫瘍が関係していると考えられる。
CALRmutationJPG.jpg

CALR(calreticulin)は高度に保存された, 多機能なendoplasmic reticulum(ER)タンパク質である。ER内ではカルシウム恒常性に不可欠な役割とタンパク質折りたたみに働いている。

ERの外では, 細胞質と膜表面に存在し, インテグリンが仲介する細胞接着, 遺伝子の核輸送, プログラムされた細胞除去, 免疫的細胞死を制御している。

CALRは特異な機能をもつ3つのドメインより構成されるN, Pドメインは主としてタンパク質シャペロン機能に関与している。

シャペロン(chaperone)とは、他のタンパク質分子が正しい折りたたみ(フォールディング)をして機能を獲得するのを助けるタンパク質の総称。分子シャペロン(molecular chaperone)、タンパク質シャペロンともいう。

一方Cドメインは主としてendoplasmic reticulum(小胞体)内のカルシウム調節にかかわっている。

さらにCドメインはKDELタンパクシークエンスを含み, 小胞体からのタンパク質分泌に関係している。

MF-PMFmutation01.jpg

primary myelofibrosis(PMF), essential thrombosis(ET)のgeneticな異常所見*8 *6*7 *9 *10 *11

フィラデルフィア染色体陰性のMPN(ETとPMF)で最多の遺伝学的異常はJAK2V617Fで症例の50-60%に検出され診断マーカになる。 MPL遺伝子異常はさらに4-10%のETとPMF症例に認められる。CALRのexon9, 体細胞異常(挿入/欠失)はJAK2V617Fについで二番目に多いET, PMFの遺伝子異常である。JAK2, MPLがwild typeのET, PMFにおいて, 50-90%の例に検出され, 重要なことはpolycytemia veraにはCALR遺伝子変異は見つからないこと

と記載したら、calreticulin mutationを示す, JAK2V617F(-), MPL(-)のPVが報告されました。*12 polycythemia vera(PV)症例の末梢血顆粒球にCALR遺伝子変異 del52bpが認められ, BFU-Eにも同様の変異が検出されたとの報告です。

このようにCALR変異はET, PMFの診断に重要な分子マーカであり, 予後においても重要な因子である。PMFではCALR変異があると良好な予後を示す。triple-negative (JAK2-, MPL-, CALR-)の症例はhigh-riskケースである。-->triple-negtive ETの新しい遺伝子変異を参照

ETにおいては, CALR変異の予後に与える影響はまだ確定していない。しかし, JAK2,MPL変異のケースと比較して, 血栓症のリスクは低いとされる。

CALR変異はET,PMFのほかRARS-Tにも低頻度に認められている. (3/24, 12.5%) &note{:

 
 
DiagnosisET-PMF.jpg

JAK2V617FのPCRによるスクリーニング

JAK2V617F allele-specific PCR*13

  • Fsp(allele-specific forward primer):5'AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT 3'--203bp band
  • Fic(internal control forward primer):5'ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG 3'--364bp internal control band
  • R(reverse primer): 5'CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA 3'

95℃ Xmin(Hot start Taqの活性化で, Taqにより異なる)

94℃ 30sec
58℃ 30sec
72℃ 45sec 35cycles

72℃ 5min - 4℃ soak

MPLW515L変異のPCRによるスクリーニング

MPL-W515L allele-specific PCR primer*3

MPL specific primer(AS-PCR forward primer): 5'CCTGCTGCTGCTGAGGTTGC 3'

  • MPL intron f primer: 5'AGTAGGGGCTGGCTGGAT 3'
  • MPL intron r primer: 5'CTAGTCGCCGAGGTGAGC 3'

internal control 409bp, mutant band 279bp. 2つのforward primersを加えてPCR. mutantがあれば2本のバンドが出る。

94℃ 30sec
65℃ 30sec
72℃ 1 min x 35cycle

CALR exon9 mutation のPCR, sanger sequencing

CALR-protein-structure.jpg

CALR exon9 sequencing primer*7

  • exon9f: 5'ACAACTTCCTCATCACCAACG 3'
  • exon9r: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG

touch down PCR
1. 95℃ X minでTaqを活性化

2. 94℃ 30 sec, 67℃ 30 sec (-1.0℃/cycle), 72℃ 30 sec x 10cycle

3. 94℃ 30 sec, 57℃ 30 sec, 72℃ 30 sec x 29 cycle

4. 72℃ 10 min, 4℃ soak

CALR exon9 mutation--> high-resolution melting analysisによる同定の論文*14*15

CALRMPL

CALR遺伝子変異は50種類以上同定されている.すべての変異がCドメインをコードするC-terminusのexon9の特定の領域に見つかる。変異によってフレームシフトをおこし36個のアミノ酸からなる共通の変異型タンパクを生じる. 変異タンパクではC末端の荷電が陰性から陽性に変化する*6

CALR-bind-to-cMPL.jpg

Araki M, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms Blood 2016; 127(10): 1307-1316 Fig.4 A-C

CALRのNドメインがないとC-MPLへの結合はなくなる。Nドメインだけだとかなり結合する。Pドメインをなくすと非常に結合能が高まる。(CALRはより強くc-MPLへ結合するようになる。). TPOがなくてもautonomous growthがおこるのはfull lengthのIns5のみである。このことから・・・

1) c-MPLへ変異CALRが結合するにはfull length, すべてのパーツ(ドメイン)が必要である。

2) PドメインはNドメインへのc-MPL結合に抑制的に働いている。野生型のCALRではPドメインの抑制作用によりc-MPLへダイレクトに結合することはほとんどない。

3) 変異CALRでは, あらたにできたC末端側, 陽性荷電チャージ部分がPドメインの抑制作用をさらに抑制している。このためc-MPLとCALRの結合が増強される.

CALRはerythropoietin receptorと結合するが(Araki M, et al. supplemental data),活性化できないことから(Araki M, et al. Figure 1D, Chachoua I et al. Figure 1B) PVの原因変異とはなり得ない。

  • BloodにCALR変異をもつPVの報告が1例ある*16が、これはどうなるのかしらん

*1  Pardanani AD, et al., MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood. 2006 Nov 15;108(10):3472-6.
*2  Pikman Y, et al., MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 2006 Jul;3(7):e270.PMID:16834459
*3  Xu W, et al., MPL W515L mutation in Chinese patients with myeloproliferative diseases Leukemia & Lymphoma 2008; 49(5): 955-958
*4  Beer PA. et al., MPL mutations in myeloproliferative disorders: analysis of the PT-1 coort. Blood 2008; 112: 141-9
*5  Marti'nez-Avile's L, et al., TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, and c-CBL genes in JAK2- and MPL-negative myeloproliferative neoplasms. Ann Hematol. 2012 Apr;91(4):533-41. doi: 10.1007/s00277-011-1330-0. Epub 2011 Sep 9.
*6  Klampfl T. et al, Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasm N Engl J Med 2013; 369(25): 2379-2390 supplement+
*7  Nangalia J, et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 2013 Dec 19;369(25):2391-405. PMID:24325359
*8  Tefferi A, et al: CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia advance online publication 21 January 2014; doi: 10.1038/leu.2014.3
*9  Rumi E,et al: JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes. Blood 2014;123 (10):1544-1551
*10  Rotunno G, et al: Impact of Calreticulin Mutations on Clinical and Hematological Phenotype and Outcome in Essential Thrombocythemia. Blood 2014;123(10):1552-1555
*11  Lundberg P, et al: Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms. Blood 2014; 123(14):2220-2228
*12  Broseus J, et al., Presence of calreticulin mutations in JAK2-negative polycythemia vera. Blood. 2014 Oct 10. pii: blood-2014-06-583161. [Epub ahead of print]PMID:25305205
*13  Baxter E et al., Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365 March19: 1054-1061
*14  Bilbao-Sieyro C et al. High resolution melting analysis: a rapid and accurate method to detect CALR mutations.PLoS One. 2014 Jul 28;9(7):e103511. doi: 10.1371/journal.pone.0103511. eCollection 2014.
*15  Lim KH et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clin Chim Acta. 2014 Nov 15;440C:133-139. doi: 10.1016/j.cca.2014.11.011. [Epub ahead of print]
*16  Broseus J et al., Presence of calreticulin mutations in JAK2-negative polycythemia vera. Blood. 2014 Dec 18;124(26):3964-6.

添付ファイル: fileCALRmut-ET-PMF.jpg 224件 [詳細] filec-mpl.jpg 252件 [詳細] fileCALR-bind-to-cMPL.jpg 317件 [詳細] fileCALR-protein-structure.jpg 332件 [詳細] fileDiagnosisET-PMF.jpg 559件 [詳細] fileCALRmutationJPG.jpg 700件 [詳細] fileMF-PMFmutation01.jpg 631件 [詳細]

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Last-modified: 2017-10-03 (火) 14:01:14 (358d)