[[WHO2016 脳腫瘍分類]]

*神経膠腫の診断はどうかわるのか--Haarlem formatやWHO2016脳腫瘍分類 [#g6c9c3e1]

新潟大学脳研究所 病理部門 高橋均先生--静岡がんセンター病理専門医養成講座2017から


**始まりはオランダハーレムのISNの会議から. [#k9851e34]

ISN(international society of neuroscience)-Haarlem format of "layered diagnosis" 2014年&note{:Louis DN, et al. International Society Of Neuropathology--Haarlem consensus guidelines for nervous system tumor classification and grading. Brain Pathol. 2014 Sep;24(5):429-35.PMID:24990071};


今までの腫瘍細胞由来がわかるような診断名--ie, astrocytoma, oligodendroglioma, glioblastoma, etc.はこれで問題ないのだけれど,

''gradeを含めたものに, 蓄積されてきた遺伝子情報をとりこまないと正しい診断とはいえないのではないか''ということで, 最終的にintegrateした診断をめざす.

「遺伝子だけではわからないのじゃないか」という反論も取り込んで進んできた。&note{:Hainfellner J et al, Letter in response to David N. Louis et al, International Society of Neuropathology-Haarlem Consensus Guidelines for Nervous System Tumor Classification and Grading, Brain Pathology, doi: 10.1111/bpa.12171.Brain Pathol. 2014 Nov;24(6):671-2.};

Haarlem会議の結論: &color(#e2041b){''Integrated diagnosisは最終的にめざす診断であって、段階的をふんで上にいきましょう.''};

Diffuse glioma(for example)

-Integrated diagnosis: 下記診断を統合して最終的にめざすべき診断; &color(red){oligodendroglioma, '''IDH'''-mut, 1p/19q codel, WHO grade II};

-Histological diagnosis: &color(blue){oligodendroglioma phenotype};

-Histological grade: &color(blue){Grade II};

-Molecular information: &color(blue){IDH-mutant, 1p/19q codeletion};

これをひとつの機関でやろうとすると相当な時間と相当なコストがかかることになる(高橋Dr)

>&photo(WHO2016gliomas.jpg); <-----''免疫染色を使って診断をすすめていくスキーム''(WHO2016blue book) クリックで拡大

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**MDACC-MDAnderson Cancer Center(TEXAS) のreport--これからの診断はこうなるんだろうという例:''Pending Integrated diagnosis'' [#i82b069e]
#ref(MDACC-diagnosis.jpg,around,80%)
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脳研究所のように神経病理の研究を主にしているところでは遺伝子のシークエンスまでしているんだけれど,ふつうはこのpending diagnosisでおわってて, でも, まずまちがいなく100% oligodendrogliomaといっていいと思っているヒトはいっぱいいるとおもう。~
でも%%%&color(red){internationalなルールからするとそれは「不完全な診断書」になっちゃうよ};というほどの非常に厳しい取り決め%%%ですね. (高橋Dr)
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***''Integrated diagnosisの例'' [#ieebc88b]

#ref(braintumor01.jpg,around,50%)
''Case01'' 43yo female recent headaches, lt. face and hand numbness.
組織はglioblastoma

''Initial Dx''

Integrated diagnosis; &color(red){Pending};

Histological diagnosis: Glioblastoma

Histological grade: Grade IV

Molecular information: &color(red){Pending};
ここには, IHCのmolecularな部分や, mitosisを書き込んでもかまわないがそれ以外の遺伝子mutationなどが強制的にはいってくるのが今の状況.

#clear
''Case Molecular data''(時間とお金をかけて行う)

Molecular surrogate immunohistochemistry:
-IDH1 R132H: negative

Molecular assays:
-EGFR, CMET FISH: negative
-PDGFRA FISH: amplified
-MGMT promoter methylation: negative
-NGS: &color(red){positive for variants in '''PTEN and TP53'''(no '''IDH''' mutation)};
-NGS fusion: negative for reportable fusion transcripts related to ALK/RET/ROS1/BRD4/NUTM1/EGFR/EWSR1 rearrangement, and MET exon14 skipping


''Final, integrated diagnosis''

Integrated diagnosis: &color(#e2041b){'''''Glioblastoma, IDH-wild type, WHO gradeIV'''''};

Histological diagnosis: &color(blue){Glioblastoma};

Histological grade: &color(blue){Grade IV};

Molecular information: &color(blue){IDH wildtype, TP53 mutant, PTEN mutant, MGMT promoter methylation negative, PDGFRA amplified.};
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われわれがおそらく今までやってきたことは、Histological diagnosisとHistological gradeは自信もってpathologistがやって, Molecular informationについてはできるだけのことをやっていたと. IHCではMIB-indexを出したり, p53を調べたり, IDH1だったら変異タンパクを検出するとか, 99%あるいは98%くらいの診断でよいとおもうんですが, できればこういうシークエンスもやってということなんですね。(高橋Dr)
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''Case 02''
#ref(braintumor02.jpg,around,50%)
4-yo, girl tilting the head to the right

HE brain stem glioma, giant multinuclear cell+, MIB-1 50%, IDH1 R132H negative, p53++~
予後はいくらもかわらない。いまのintegrated diagnosisにあわせるとやっかい。

大事なのはhistonの異常をしらべなければならない. Histon H3.1 '''HIST1H3B'''K27M~
この遺伝子異常によるタンパク質は免疫染色で検出できる抗体がある。かならずしもsequenceしなくてよい.
#clear

''Final integrated diagnosis''

Integrated diagnosis: &color(#e2041b){''Diffuse midline glioma(brainstem glioma) H3K27M-mutant, WHO gradeIV''};

Histological diagnosis: Glioblastoma

Histological grade: Grade IV

Molecular information: 
-IDH wild-type(IHC)
-H3.1 HIST1H3B K27M mutant
-H3.3 H3F3A K27 wild type, G34 wild type

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''Case 03''--5.8yo boy-WHO2016のレベルでもPending になるケース.

#ref(T-Case.jpg,around,left)
一見するとparagangliomaみたいな, oligodendroglial-like cellのような細胞がはいってきてsynaptophysin(+), GFAP部分+でもしかしたらglioneural tumorかなというcase. ~
OLIG2+, MAP2,S-100(+), GFAP(+/-), synaptophysin(+)

differential diagnosis
-Leptomeningeal dissemination:
-diffuse astrocytoma or oligodendroglioma:
-pilocytic astrocytoma

-Pleomorphic xanthoastrocytoma, ganglioglioma
#clear

Final, integrated diagnosis

Integrated diagnosis: &color(red){Pending}; WHO2016レベルでもpendingの腫瘍

Histological diagnosis: &color(#e2041b){''Diffuse leptomeningeal glioneuronal tumor''};

Histological grade: Grade ?

Molecular information: IHC: positive for synaptophysin, GFAP, negative for S-100

-&color(red){KIAA1549-BRAF fusion, not confirmed.};

Diffuse leptomeningeal glioneuronal tumorという, 新しく加わった腫瘍で予後のはっきりしない, しかし顕微鏡レベルやMRIレベルでみるととてもじゃないけど予後不良だなというdisseminationしている腫瘍.細胞成分としてはそんなに悪くない.

今このWHOレベルでもintegrated diagnosisはpending。Histological diagnosisとしてははっきりいえる。まだまだ症例が足らなくて, もうすこし症例を集めてgradeを検討しよう。これから先は, molecular informationについては調べていきましょうということです。これでも正式な診断書というレベルの腫瘍も新しく加わった腫瘍にはあるんですね。


**MGMT; OSUP{SIZE(8){6}};-methylguanine-DNA methyltransferase [#pc45886d]

テモゾロミド(Temozolomide:''TMZ'')は経口投与可能な抗がん剤. 商品名テモダール。アルキル化剤に属し, 初発・再発の星状細胞腫(膠芽腫等)の悪性度の高い脳腫瘍の治療に用いられるほか, 海外では悪性黒色腫の治療にも用いられる。 また承認外用法として乏突起神経膠腫の治療に、旧来の忍容性の低いPCV療法(プロカルバジン、ロムスチン、ビンクリスチン)の代わりに用いられている国もある。
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MGMT promoter領域のメチル化状態とTemozolomide(TMZ)による脳腫瘍治療
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-&color(red){MGMT promoter CpG islandがメチル化}; ---> MGMTメチル化症例--->MGMTが発現しない--> &color(red){TMZがききやすい};
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-&color(blue){MGMT promoter CpG islandがメチル化していない};--->MGMTが発現する--->&color(blue){TMZは効きにくい.};
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特殊な装置がなくてもPCRのできる環境でメチル化の検査-->MGMTpromoter Methylation-specific PCR&note{:Esteller M, et al.Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia.Cancer Res. 1999 Feb 15;59(4):793-7.};

#ref(MGMTprom-primers.jpg,around,left,80%)
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bisulfate処理にはQiagenのEpitect Fast Bisulfate kitを使用している. 最後のDNA抽出ではDNAが低濃度にならないように注意. NanodropなどでDNA量を測定しておく。
bisulfate処理にはQiagenのEpitect Fast Bisulfate Conversion kitを使用している. 最後のDNA抽出ではDNAが低濃度にならないように注意. NanodropなどでDNA量を測定しておく。

MGMT-M (Methylated) primer; ~
forward: 5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC~
reverse: 5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG~

MGMT-U (unmethylated) primer;~
forward: 5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT~
reverse: 5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA~

PCRは HotStart Taq, 95℃ 15min, ~
40cycleで94℃ 30sec, aneal 59-57℃ 30sec, 72℃ 1min. ~
1 cycle 72℃ 10min, 4℃ soak. primerがA, Tが多くなるのでcycleは40cycleに増やしている.~
anealing tempはEstellerの論文では59℃. 57℃だとよりきれいにbandが出る。

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