[[WikiPathologica]]

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*NotchとNotchシグナリング [#n8873ae9]

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Notchシグナル伝達系は 

動物のさまざまな臓器の発生過程, 成体でのホメオスタシス, 幹細胞機能などに関与するとともに, その異常はがんなど多種の疾患のもとになる.

''Notchの歴史''&note{:山本慎也ほか Notchシグナルの世界 実験医学 2016; 34(3);380-389};

1913年, ''Thomas Hunt Morgan'' の研究室で切り込みの入った翅をもつ雌のショウジョウバエが見つかった. 翅の先端がわずかに欠けた変異体はNotchと名付けられ, 研究が始められた. ~
Morganの研究室では偶発的にショウジョウバエに現れる突然変異体を探して, 遺伝学の研究に用いていた. 白い眼のwhiteや体色の黄色いyellowを用いた研究によりMorganは1933年にノーベル医学・生理学賞を受賞している.

Notchの研究はDonald Poulsonにより本格的に始められた. 彼は'''Notch'''変異のホモ接合体では外胚葉から表皮が形成されず, かわりに神経組織に置き換わっていることを1930年代に発見した.

この「neurogenic」と呼ばれる表現型の解析により''正常'''Notch'''遺伝子は外胚葉の将来表皮になる予定の細胞が神経系への運命をたどることを抑制する機能をもつことが示された.''

Notchは単一遺伝子が外胚葉の運命決定という重大事象にかかわっていることを初めて示した事例であり, 遺伝子が発生現象にかかわるという説に懐疑的であった発生学者に大きなインパクトを与え, 発生遺伝学の礎のひとつになった。

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**ショウジョウバエ(Drosophilidae), キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の発生とNotch [#wf7c4831]

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>''側方抑制''; ショウジョウバエの腹側神経予定域では, ニューロンに分化する細胞はDeltaリガンドを強く発現し, 隣接細胞が発現するNotch受容体を活性化することで, 周囲の細胞がニューロンに分化するのを抑制している.
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>''細胞系譜決定''; 剛毛の形成では, 1つの細胞系譜からシャフト細胞, ソケット細胞, グリア, ニューロンが分化するが, Notchシグナルが欠損するとニューロンのみが分化する.
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>''境界形成''; 翅の縁でNotchシグナルが働き, 背側と腹側の境界をつくる. この過程において Notchシグナルが欠損すると, その部分にへこみ(Notch)が生じる. 

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脊椎動物発生でのNotchシグナルの働き方はショウジョウバエのように詳細には定義されていないが, アフリカツメガエルやゼブラフィッシュの一次ニューロン産生においてNotchシグナルが側方抑制をおこなうことや体節形成でも, Notchシグナルが重要な働きをしていることが示されている.

>
哺乳類大脳皮質におけるニューロン分化や血球細胞分化ではNotchシグナルを受容した細胞は幹細胞状態を維持する.
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***Notch遺伝子とコードするタンパク [#t521d534]

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Notch遺伝子クローニングと配列決定は1985年に発表された. 

NOTCH1--[[NCBI ID4851>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4851]] Location: &color(#e2041b){''9q34.3''}; Exon count:34~
GRCh38.p12 (GCF_000001405.38) Chr9 NC_000009.12 (136494433..136545786, complement) 

&color(crimson){''大きな, 約200kDの細胞外領域と約120kDの細胞内領域をheterodimericに持つ受容体のようなI型膜貫通タンパク質をコードする''};ことが明らかにされた.

''Notchタンパク質''

-哺乳類では'''Notch1からNotch4'''まで4種類の'''Notch'''遺伝子が知られており4遺伝子は, いずれも細胞膜を1回貫通するタイプの受容体型タンパク質をコードする.
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-Notchタンパク質は細胞膜に到達する前にゴルジ体でfurin-like convertaseによる分子内切断(S1 cleavag)を受けて細胞表面には2量体として発現される.&note{:Blaumueller CM,et al Intracellular cleavage of Notch leads to a heterodimeric receptor on the plasma membrane. Cell. 1997 Jul 25;90(2):281-91. PMID:9244302};
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-この際, 細胞外サブユニット(NEC)と膜貫通サブユニット(NTM)はNECのC末端103アミノ酸(HDN)とNTMのN末端の65アミノ酸の非共有結合により会合していることが示されている.&note{:Sanchez-Irizarry C, et al. Notch subunit heterodimerization and prevention of ligand-independent proteolytic activation depend, respectively, on a novel domain and the LNR repeats. Mol Cell Biol. 2004 Nov;24(21):9265-73.PMID:15485896};
#br
-細胞外領域には特徴的な上皮成長因子(EGF)様繰り返し配列が存在し, Notchの種類により29〜36回繰り返され, 細胞外領域は約200kDaにおよぶ.
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-細胞内領域にはN末端側から, 1) ''RAMドメイン''(DNA結合タンパクであるRBP-Jk[CSLとも呼ばれる]と結合する領域), 2) ''核以降シグナル(NLS)'', 3) ''アンキリン繰り返し配列''(さまざまなタンパクと結合し複合体を形成する中心的領域) 4) ''核以降シグナル'' 5) ''転写活性化領域(TAD)'' 6) ''PEST領域''(ユビキチンが結合しタンパクの分解に関与する領域) の機能領域が同定されている.
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Notchの正体がわかる数年前に, 胚発生においてNotchと同様のneurogenicな表現型を示す遺伝子が6つ--'''''Delta, mastermind, neuralized, Enhancr of split, almondex, big brain'''''--発見された.

-&color(#e2041b){'''''Delta(Dl)'''''};はNotchのリガンドをコードすることがわかり, もう一つの重要なNotchリガンドをコードする&color(#e2041b){'''''Serrate(Ser)'''''};はNotchに似た翅に切れ込みの入った表現型をもつ変異体から同定された.
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-ショウジョウバエの末梢神経の一部となる感覚毛の発生(Notch依存的)に異常のある変異体の解析から&color(#e2041b){'''''Suppressor of Hairless[ Su(H)]'''''};が発見され, この遺伝子がDNA結合能をもつ転写因子であることが示された.&note{:Schweisguth F, Posakony JW.Suppressor of Hairless, the Drosophila homolog of the mouse recombination signal-binding protein gene, controls sensory organ cell fates. Cell. 1992 Jun 26;69(7):1199-212.PMID:1617730 };&note{:Furukawa T, et al. The Drosophila RBP-J kappa gene encodes the binding protein for the immunoglobulin J kappa recombination signal sequence. J Biol Chem. 1991 Dec 5;266(34):23334-40.PMID:1744127};
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-neurogenic遺伝子の1つである &color(#e2041b){'''''mastermind(mam)'''''};がクローニングされ&note{:Smoller D, et al.The Drosophila neurogenic locus mastermind encodes a nuclear protein unusually rich in amino acid homopolymers. Genes Dev. 1990 Oct;4(10):1688-700.PMID:1701150};, ''MamはSu(H)に結合し'', コアクチベータをリクルートする核内因子と働くことが明らかになった.
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-Notchと関連遺伝子の発見同定により, Notchは細胞間シグナル伝達に働くことがわかり, Notch変異体に発現するneurogenic表現型は将来表皮になるはずの細胞と神経系になるべき細胞間のコミュニケーション異常により遺伝子レベルで引き起こされることがわかった.&note{:Artavanis-Tsakonas S, et al.Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science. 1999 Apr 30;284(5415):770-6. Review. PMID:10221902};
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''Notchシグナルに関わるホモログ''--哺乳類

Notch受容体

>4つ'''''Notch''''':---'''''NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4'''''

リガンド

>3つの'''''Dl''''':---'''''Delta-like1(DLL1), DLL3, DLL4.''''' (2は欠番)

>2つの'''''Ser''''':---哺乳類では'''''JAGGED1(JAG1), JAG2'''''

>1つの'''''Su(H)'''''RBPJ. (クローニング・同定はSu(H)の先におこなわれた. 別名: RBP-Jk, CBF1, KBF2, CSLなど)

>3つの'''''mam''''':---'''''Mastermind-like1(MAML1), MAML2, MAML3'''''

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''Notch signaling''

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>Notch受容体は,''1回膜貫通型タンパク質''で機能的な細胞外ドメイン(NECD),膜貫通ドメイン(TM),及び細胞内ドメイン(NICD)からなる。



>シグナルの受け手細胞内では, mRNAから翻訳されたNotch受容体タンパク質は小胞体(ER)およびゴルジ体において, Furin様プロテアーゼにより切断(S1切断)され, Fringeにより糖修飾をうけて成熟し細胞表面に提示される. カルシウムイオン (Ca2+) によって安定化され, ''膜に挿入されたTM-NICDと非共有結合で接着しヘテロ二量体 heterodimer''を生じる.

>このプロセッシングを受けた受容体は,次に細胞膜へ移行し,リガンドを結合できるようになる。哺乳類では,シグナルを送る側の細胞に存在するDelta様 (DLL1,DLL3,DLL4) 及びJagged (JAG1,JAG2) ファミリーのメンバーが,Notchシグナル受容体に対するリガンドとして働く。

>リガンドが結合すると直ちに,NECDは''TACE (ADAM金属プロテアーゼTNF-α変換酵素) ''によってTM-NICDドメインから切り離される (S2切断)。

>このNECDはリガンドに結合した状態を維持し,この複合体はシグナル送信側の細胞内でエンドサイト―シスとリサイクリング/分解を受ける。


>シグナル受信側の細胞内では,&color(crimson){''γ-セクレターゼ''}; (アルツハイマー病にも関与する) がTMからNICDを遊離する (S3切断) が,これによってNICDは核内へ移行し,そこでDNA結合因子 CSL [CBF1/Su(H)/Lag-1/RBPjともよばれる] ファミリー転写因子複合体と直接的に結合する.

>&color(blue){CSLはNotchシグナル不活性(NICDが存在しない)状態では};,転写コリプレッサーのSMRTやヒストン脱アセチル化酵素のHDACなどの転写抑制因子とともに働いて,&color(blue){下流遺伝子発現を抑制している.};

>&color(crimson){核内でCSLにNICDが結合すると};MAML(転写コアクチベータ)やHAT(ヒストンアセチル化酵素)などと複合体を形成, &color(crimson){下流遺伝子発現を活性化する.};
>
-下流遺伝子のうち, bHLHタイプの転写抑制因子Hes1とHes5はニューロン分化を促進する遺伝子群発現を抑制する.
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-Hes遺伝子群はNotchシグナル下流で骨髄における造血細胞分化を抑制している.
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-Mib, Neurはユビキチン修飾によりDeltaリガンドの活性制御をおこなう.


>細胞内分子Numbは非対称細胞分裂時に不均一に分配され, Numbを含む娘細胞ではNotch分子はエンドサイトーシスとユビキチン化によりシグナルが抑制される.


//会合の結果引き続いて,基準的なNotchの標的遺伝子であるMyc,p21及びHESファミリーメンバーの活性化が起こる。


>Notchシグナル経路は,ヒトの疾患との関連があるために薬理学的な介入に向けた興味を加速させてきた。&color(#e2041b){''重要なことは,NICDの核内への蓄積に結び付くようなNotch受容体の活性化型変異は,成人T細胞急性リンパ芽腫性白血病及びリンパ腫に共通していることである''};。さらに,機能欠失型のNotch受容体及びリガンドの変異は,アラジール (Allagille) 症候群や,常染色体優性型の大脳動脈症であるCADASILなどの数々の疾患への関与が示唆されている。
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''他のシグナル伝達系にはみられないNotchシグナルの特徴''

1. &color(red){''シグナルが多くの場合, 隣り合った細胞間のみでおこる.''};
>
Notchシグナル受容体のリガンド, DeltaとSerrate(哺乳類ではJagged)は, 受容体とおなじくI型膜貫通タンパク質であり, シグナルの活性化には2つの細胞が隣接し, 細胞表面上でリガンドと受容体が直接結合することが必須である.
>
リガンドとの結合によりNotch受容体は構造変化をおこし, タンパク質切断酵素のADAM protease, およびγ-secretaseによって細胞内領域(NICD)が切り離される.


2.''シグナル伝達にはセカンドメッセンジャーを必要とせず, またシグナル増幅はおこなわれない.''&note{:Kopan R, & Ilagan MX.The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 2009 Apr 17;137(2):216-33. PMID:19379690};
2.&color(red){''シグナル伝達にはセカンドメッセンジャーを必要とせず, またシグナル増幅はおこなわれない.''};&note{:Kopan R, & Ilagan MX.The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 2009 Apr 17;137(2):216-33. PMID:19379690};
>
膜より切り離されたNICDは核内に移行し, DNA上でSuppressor of HairlessやMastermindなどの転写因子, co-activatorと相互作用することで下流遺伝子の転写をNotch自身が直接促進する.


3.''Notch受容体やリガンドの翻訳後修飾や細胞内小胞輸送がシグナル強度を調節するうえに非常に重要な役割を果たしている''&note{:Rana NA, Haltiwanger RS. Fringe benefits: functional and structural impacts of O-glycosylation on the extracellular domain of Notch receptors. Curr Opin Struct Biol. 2011 Oct;21(5):583-9. PMID:21924891};
3.&color(red){''Notch受容体やリガンドの翻訳後修飾や細胞内小胞輸送がシグナル強度を調節するうえに非常に重要な役割を果たしている''};&note{:Rana NA, Haltiwanger RS. Fringe benefits: functional and structural impacts of O-glycosylation on the extracellular domain of Notch receptors. Curr Opin Struct Biol. 2011 Oct;21(5):583-9. PMID:21924891};
>
Notchシグナルにはリン酸化カスケードといった増幅機能が備わっていないのでリガンドや受容体の発現量や安定性, 細胞表面上でのNotch受容体の切断量によりシグナル強度が大きく左右される.
>
Notchシグナルは弱すぎても強すぎても個体の発生異常をきたすことが知られている. またNotch遺伝子は組織によってがん遺伝子(白血病)としてもがん抑制遺伝子(皮膚がん)としても機能しているため, シグナル強度の微調整がどのように行われているのかを知ることはNotchシグナルを制御していく上で不可欠となる.&note{:Louvi A, Artavanis-Tsakonas S. Notch and disease: a growing field. Semin Cell Dev Biol. 2012 Jun;23(4):473-80. PMID:22373641};
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''NOTCHリガンド(DSLタンパク質)''

-Notchリガンドは1回膜貫通型タンパク質で, N末端側に&color(red){''DSL(Delta-Serrate-LAG-2)ドメイン''};をもつことで特徴づけられる.
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-''DSLドメインは受容体との結合に必須である''がリガンドと受容体がどのように相互作用するか分子レベルでは解明されていない.
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-リガンドは大きく ''Delta(Delta-like)とSerrate(哺乳類ではJagged)''の2つのタイプに大別される. 2つの構造的な違いは, JaggedメンバーにはC型 von Willebrand因子ドメインに類似した, システインに富む膜近傍領域していること.&note{:Lissemore JL, Starmer WT. Phylogenetic analysis of vertebrate and invertebrate Delta/Serrate/LAG-2 (DSL) proteins. Mol Phylogenet Evol. 1999 Mar;11(2):308-19. PMID:10191075};
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-哺乳類にはリガンドをコードする5種類の遺伝子が存在する.3種類のDelta様タンパク質をコードする Delta1, 3, 4と2種類のJaggedタンパク質をコードする Jagged1, 2である.
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-Notch受容体とそのリガンドは多くのEGF様ドメインをもつため, 細胞外ドメインは長く, 可変性がある. 可変性を示す部位はCa2+が結合するドメインに限局する. DSLドメインとの結合にはEGF様ドメインの多くの部位が関与している.
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**Notchと血球分化 [#vab803bd]

''正常血球の発現: RT-PCRによるmRNAレベルおよびFACSでのタンパク質レベル解析''&note{Saito:Saito T, et al. Notch2 is preferentially expressed in mature B cells and indispensable for marginal zone B lineage development.Immunity. 2003 May;18(5):675-85. PMID:12753744};&note{Lee:Lee SU, et al. LRF-mediated Dll4 repression in erythroblasts is necessary for hematopoietic stem cell maintenance.Blood. 2013 Feb 7;121(6):918-29.PMID:23134786};&note{Oh:Oh P, et al.In vivo mapping of notch pathway activity in normal and stress hematopoiesis.Cell Stem Cell. 2013 Aug 1;13(2):190-204.};

''Notch1''---HSPCs, リンパ球系前駆細胞, 未熟T細胞に発現

-Notch1のcKOマウスでは, 胸腺でのT細胞産生が阻害され, 胸腺異所性B細胞産生がみられる.&note{Saito:Saito T, et al. Notch2 is preferentially expressed in mature B cells and indispensable for marginal zone B lineage development.Immunity. 2003 May;18(5):675-85. PMID:12753744};
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-Notch1を介したシグナルはHSPCsが胸腺でB細胞あるいはT細胞へと分化する運命決定に必須である.

''Notch2''---HSPCs, 各系統の前駆細胞, 成熟B細胞&note{Saito:Saito T, et al. Notch2 is preferentially expressed in mature B cells and indispensable for marginal zone B lineage development.Immunity. 2003 May;18(5):675-85. PMID:12753744};, 肥満細胞, 樹状細胞に発現

''Notch3''---未熟T細胞に限定して発現&note{Saito:Saito T, et al. Notch2 is preferentially expressed in mature B cells and indispensable for marginal zone B lineage development.Immunity. 2003 May;18(5):675-85. PMID:12753744};&note{Lee:Lee SU, et al. LRF-mediated Dll4 repression in erythroblasts is necessary for hematopoietic stem cell maintenance.Blood. 2013 Feb 7;121(6):918-29.PMID:23134786};

''Notch4''---血球系での発現はかなり低いと考えられている.&note{Oh:Oh P, et al.In vivo mapping of notch pathway activity in normal and stress hematopoiesis.Cell Stem Cell. 2013 Aug 1;13(2):190-204.}; 血管内皮細胞に発現し, リガンドは主にストローマ細胞(血管内皮を含む)や抗原提示細胞に発現している.&note{:Radtke F, et al. Notch regulation of lymphocyte development and function.Nat Immunol. 2004 Mar;5(3):247-53.PMID:14985712};

//KOマウスによる知見.

//-胸腺上皮で, '''Dll4'''を欠損したマウス(FoxN1-Cre)が, '''Notch1'''欠損マウスと同様の表現型を示すことから, 主に&color(crimson){Notch1-Dll4を介したシグナルがHSPCsからT細胞への運命決定に関与している};と考えられる.
#br
//-転写因子'''LRF'''('''Zbtb7a''')cKOマウスが骨髄赤芽球でのDll4の異所性発現を誘導することが報告された.
//>
//異所性に発現したDll4は骨髄のlong term HSC(LT-HSC)上に発現しているNotch1にシグナルをおくり結果, 骨髄での異所性T細胞産生と同時にB細胞分化障害が起こる. この表現型は, Notch1欠損や抗Dll4抗体によりほぼ完全に消失する.
//>
//LT-HSCでNotch1(および,Notch2)が発現しており, 骨髄微小環境においても胸腺のようにDll4をエンゲージすればT細胞の産生がおこること, また生理的条件下ではLT-HSCでのNotch1/Dll4シグナルは不活化, もしくはかなり低いレベルにある.

//#br
//-斎藤らは, 2系統のNotch2cKOマウスを樹立.
//>
//Notch2はT細胞分化には不必要. 脾臓におけるmarginal zone B-cellの発生に必須であることが示された.&note{Saito:Saito T, et al. Notch2 is preferentially expressed in mature B cells and indispensable for marginal zone B lineage development.Immunity. 2003 May;18(5):675-85. PMID:12753744};
//>
//Notch2はHSPCで高発現しているが, その機能は不明な点が多い.


***Notchとリンパ球系悪性腫瘍 [#q6e23349]

NOTCH1-TCRβfusion; t(7;9)(q34;q34.4)

-T-ALLの1%以下に見られる, まれな異常.

-NOTCHシグナルの異常制御はヒトおよびマウスにT-ALLを生じさせる.&note{:Ellisen LW, et al. TAN-1, the human homolog of the Drosophila notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms.Cell. 1991 Aug 23;66(4):649-61.PMID:1831692};
&note{:Pear WS, et al. Exclusive development of T cell neoplasms in mice transplanted with bone marrow expressing activated Notch alleles. J Exp Med. 1996 May 1;183(5):2283-91. PMID:8642337};

NOTCH1遺伝子変異(activating mutation;AM)によるNOTCH1恒常的活性化.&note{:Weng AP, et al. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia.Science. 2004 Oct 8;306(5694):269-71.PMID:15472075};

-T-ALLの50%前後と高率に認められる.

-S1およびS2切断がおこなわれる&color(#e2041b){''HDドメインとPESTドメインの2つのhot spotがある''};.

-HDドメインの変異ではヘテロ二量体形成不全がおこり, リガンド非依存性に, γ-secretaseによるNotch1のS3切断を誘発しNICD産生を促進する

-PESTドメイン変異は''SCF-FBW7ユビキチンリガーゼ''を介したNICD分解を阻害し, NICDの半減期延長, 安定化をもたらす.







//Notchシグナルは,分化していく細胞集団のなかで,将来再生に寄与する幹細胞あるいは前駆細胞を残す役割をはたす.

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